Niskie prezbiterium, w przeciwieństwie do rozświetlonych naw, jest dosyć mroczne, bowiem smukłe okna umieszczone tylko w jego wielobocznym zamknięciu zostały częściowo przesłonięte olbrzymim ołtarzem. Ciężką kolebę sklepienia dekorują listwy sztukateryjne o układzie geometrycznym, typowym dla renesansowej sztuki włoskiej (kwadraty i prostokąty połączone ćwierćkolami), wg proj. Moranda. Pierwotny ołtarz główny, drewniany, wczesnobarokowy, z obrazami zamówionymi w latach 1602—04 przez hetmana Jana Zamoyskiego w Wenecji u Domenica Tintoretta, został przewieziony w 1783 do Tarnogrodu. Obecny ołtarz ze stiuku, marmoryzowany, wykonany w latach 1783—85, odznacza się monumentalnymi, nieco ciężkimi, późnobarokowymi formami architektonicznymi i typowymi dla tego stylu efektami teatralnymi. Przy kolumnach figury boczne nadnaturalnej wielkości, przedstawiające patronów fundatora kolegiaty: św. Jana Chrzciciela i św. Jana Ewangelistę, natomiast pośrodku — święci apostołowie Piotr i Paweł. Malowany równocześnie z ołtarzem obraz środkowy przedstawia, zgodnie z wezwaniem kościoła, scenę Niewiernego Tomasza apostoła. W zwieńczeniu ołtarza rzeźbiona grupa Trójcy Sw. wśród obłoków z aniołami. Okazałe, srebrne, rokokowe tabernakulum jest nieco wcześniejsze od ołtarza i pochodzi z 1. 1744—48. Zostało wykonane we Wrocławiu przez złotnika Beniamina Hentschla wg proj. Jerzego de Kawe. Godne uwagi są tu: znakomicie modelowane figury aniołów, u góry scena zaparcia się św. Tomasza apostoła oraz po bokach herby Jelita i Rawicz fundatorów Tomasza Antoniego Zamoyskiego i jego żony Teresy z Michowskich. We wnęce tabernakulum stoi późnorenesansowy pacyfikał (krzyż z relikwiami) sprzed 1618, fundacji Tomasza Zamoyskiego; zawiera elementy wcześniejsze, pochodzące z gotyckiej monstrancji. Ciekawy jest komplet 6 srebrnych barokowych lichtarzy na ołtarzu, z ok. 1730, z herbami fundatorów — ord. Michała Zdzisława Zamoyskiego i jego żony Elżbiety Korybut–Wiśniowieckiej.
Na ścianach prezbiterium wiszą 4 wielkie obrazy na płótnie przedstawiające cykl z życia św. Tomasza apostoła. Na ścianie pd. sceny związane ze sceptycyzmem Niewiernego Tomasza: Chrystus otrzymuje wiadomość o umierającym Łazarzu; Chrystus wśród apostołów po Ostatniej Wieczerzy. Na ścianie pn. obrazy przedstawiają działalność apostolską św. Tomasza: św. Tomasz nawracający pagan w Indiach; Męczeńska śmierć św. Tomasza (przebijany przy ołtarzu trzema włóczniami). Obrazy te, odznaczające się cechami weneckiej szkoły manierystycznej, dawniej niesłusznie uchodzące za dzieła Domenica Tintoretta, zostały namalowane w kraju ok. 1627 z fundacji Tomasza Zamoyskiego, zapewne przez malarza nadwornego ordynata —Jana Kasińskiego.
Prezbiterium odgradza piękna balustrada kuta z żelaza, o bujnych motywach roślinno-kwiatowych, z początku XX w.
W przejściu z prezbiterium do pd. nawy bocznej w posadzce umieszczone są drzwi żelazne z herbami Zamoyskich i napisem z brązu: „Fundatoribus Grata Memoria Anno 1779” („Fundatorom wdzięczna pamięć”), prowadzące do krypt z prochami ordynatów Zamoyskich i ich rodzin od XVI do XX w., począwszy od fundatora miasta i kolegiaty Jana Zamoyskiego (krypty udostępniane są dla zwiedzających po zgłoszeniu się do kościelnego). Najwybitniejsi przedstawiciele rodu są pochowani w krypcie pod kaplicą Zamoyskich.
Obok, na filarze po lewej stronie bogato rzeźbione i polichromowane epitafium Pawła Piaskowskiego (zm. 1613 w Szarogrodzie), towarzysza wypraw wojennych hetmana Jana Zamoyskiego. Jest to dzieło w stylu manierystycznym ze szkoły gdańskiej, zapewne z warsztatu van den Blocków. Przy prezbiterium, na przedłużeniu nawy pd., kaplica Zamoyskich p.w. Przemienienia Pańskiego, zw. też Ordynacką, zamknięta bogatą kratą żeliwną ozdobioną brązowymi włóczniami herbu Jelita, proj. Jana Heuricha starszego z 3 ćwierci XIX w. Wnętrze wyróżnia się pięknymi barokowymi sztukateriami z ok. 1635, będącymi dziełem włoskiego sztukatora Jana Baptysty Falconiego. Zwracają uwagę motywy muszli z geniuszami sławy, kartusze i panoplia — wiązki broni i zbroi. W posadzce płyta nagrobna Jana Zamoyskiego wykonana z czarnego marmuru, z elementami z brązu. Krótki napis łaciński tłumaczy się: „Tu leży Jan Zamoyski — zmarł roku pańskiego 1605, dnia 8 czerwca”, a skrzyżowane pieczęć i buława stanowią insygnia kanclerskie i hetmańskie zmarłego. Forma nagrobka, programowo skromna, została wykonana ściśle wg ostatniego testamentu hetmana przez syna Tomasza ok. 1618 (z dodaniem czterodzielnej tarczy herbowej i panopliów w obramieniu). Herby na tarczy określają związki rodowe hetmana po linii ojca (pod herbem rodowym Jelita — Zamoyskich, herb Suchekomnaty — Uhrowieckich) i po linii matki (herb Herburt — Herburtów, niżej herb Bończa — Fredrów). W napisie pomylono datę, bowiem hetman zmarł 3 czerwca.
Obok prostej płyty znakomitego hetmana pretensjonalnie wygląda usytuowany w rogu kaplicy nagrobek XIV ord. Tomasza S. Zamoyskiego (zm. 1889), z postacią na łożu, w niebiańskiej wizji przedśmiertnej. To naturalistyczne dzieło z białego marmuru karraryjskiego wykonał w 1891 włoski rzeźbiarz Antonio Argenti z Mediolanu. Przy ścianie pn. znajdują się stalle kollatorskie, neobarokowe z ok. 1870, z 4 epitafiami w zapieckach, poświęconymi najwybitniejszym przedstawicielom rodu Zamoyskich pochowanym pod kaplicą (Jan, hetman wielki koronny zm. 1605; Tomasz kanclerz wielki koronny zm. 1638; Marcin, podskarbi wielki koronny zm. 1689; Andrzej, kanclerz wielki koronny zm. 1792). Nad stallami wiszą w bogatych obramieniach 2 okazałe portrety Jana Zamoyskiego i jego syna Tomasza, pędzla Wojciecha Gersona z 1869. Wizerunki te, w pełnej postaci, utrzymań* są w typie portretów staropolskich. W drewnianym neobarokowym ołtarzu z ok. 1870 znajdują się obrazy: przedni zasuwany — scena Przemienienia Pańskiego (nawiązująca do słynnej kompozycji Rafaela) oraz Trójca Sw. z 1869, obydwa pędzla Rafała Hadziewicza, malarza pochodzącego z ziemi zamojskiej; w zwieńczeniu „św. Anna nauczająca Marię”, tego samego malarza.
W pierwszej przy nawie pd. kaplicy Różańcowej, w ołtarzu na zasuwie neobarokowy obraz na płótnie przedstawiający Matkę Boską Różańcową ze św. Dominikiem, pędzla Józefa Buchbindera z 1908.
Za nim umieszczona jest ikona ruska na desce, „czarna” Madonna z Dzieciątkiem z XVI w., w srebrnej sukience barokowej (według tradycji przywieziona przez hetmana Zamoyskiego z wojny moskiewskiej). Na prawym filarze przy wejściu do kaplicy skromna tablica epitafijna z czarnego marmuru, Floriana Zamoyskiego, chorążego chełmskiego (zm. 1638). Na przeciwległym filarze międzynawowym równie skromne, wykonane z orązowego marmuru epitafium Szymona Szymonowlcza (Simonidesa; zm. 1629), znakomitego poety, autora „Żeńców”, współorganizatora Akademii Zamojskiej, wychowawcy Tomasza Zamoyskiego. Tablicę ufundował Kacper Solski, profesor Akademii, siostrzeniec Szymonowlcza.